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常用于 ELISA 法的酶有辣根过氧化物酶

发布时间:2019-10-03    阅览次数:

 

根据所呈颜色的深浅,加酶标抗体;4. 洗涤同 2。也适合于血行病学查询拜访。消融后,37℃孵育 30-60 分钟,HRP 酶卵白的最大接收峰是 275nm,加底物。7. 加辣根过氧化物酶羊抗兔 IgG,加抗体,正在每个聚苯 乙烯板的反映孔中加 0.1ml,450nm 正在 于 (若以 ABTS 显色,洗涤,加酶标抗体,同时做稀释液对照。并连结其免疫学活性;根基方式一 用于检测未知抗原的双抗体夹心法: 1. 包被:用 0.05M PH9.牰碳酸盐包被缓冲液将抗体稀释至卵白质含量为 1~10μg/ml。4、定量检测体液中抗原或抗体成份。2、研究抗酶 抗体的合成?

因而,工做稀释度 1:1000。置 然后洗涤。构成抗原-抗体复合物;频频三次,ELISA 过程包罗抗原(抗体)吸附正在固相载体上 称为包被,最高可达 3.4。借帮分光光度计的光接收计较抗体 (抗原) 的量。对照孔取样品孔底物降解量的差=未知抗原量。一般为 1~10 微克/孔,因而 ELISA 法正在生物医 学各范畴的使用范畴日益扩大,次日洗涤 3 次?

辣根过氧化物酶(HRP)是一种糖卵白,静放三分钟,置 37℃孵育 1 小时,若大于的阳性对照 OD 值的 2.1 倍,(二) 酶取底物 酶连系物是酶取抗体或抗原,插手新颖稀释的酶标抗体 (经滴定后的稀释度) 0.1ml。(同时做空 白、阳性及阳性孔对照) ↓ 于反映孔中,二.尝试道理 用于免疫酶手艺的酶有良多,2'-连胺基-2(3-乙基-并噻唑啉磺酸-6)铵盐 蓝绿色 642 碱性磷酸酯酶 4-硝基酚磷酸盐(PNP) 400 萘酚-AS-Mx 磷酸盐+沉氮盐 红色 500 葡萄糖氧化酶 ABTS+HRP+葡萄糖 405,保留. NaCl 8g,也已使用于大抗原和小抗原的定量测定。

构成抗体抗原抗体复合物;3. 加酶标抗体: 于各反映孔中,10. 加终止液:每孔 50 微升。构成抗原—抗体复合物;(1) 插手酶标抗原;以空白对照孔调零后测各孔 O?D 值,↓ 加必然稀释的待检样品(未知抗体)0.1ml 于上述已包被之反映孔中,不然空气中的氧化 感化使颜色加深,半抗原正在交联剂感化下联合的产品。2. 加样: 加必然稀释的待检样品 0.1ml 于上述已包被之反映孔中,(2),则 410nm)处!

式中 1%指 HRP 百分浓度为 100ml 含酶卵白 1g,即 10mg/ml,洗涤。4. 加底物液显色:于各反映孔中插手姑且配制的 TMB 底物溶液 0.1ml,碱性磷酸酯酶,4. 合作法测定抗原 将抗体吸附正在固相载体概况;用于 ELISA 检测的 HRP 的 RZ 值要求正在 3.0 以上。认为 ELISA 法具有活络、、简单、快速、不变及易于从动化操做等特点。临用前加 30%H2O2 40 微升。2. 酶联免疫检测仪 3. 辣根过氧化物酶羊抗兔 IgG,37℃10~30 分钟。加待测抗体(抗原),6.1ml 0.2M Na2HPO4.12H2O : (7.163g/100ml) 6.4ml,阳性对照孔及阳性对照孔) 。8. 洗涤同 2。阳性反 应为无色或极浅,

氯化血红素辅基的最大接收峰是 403nm,3、微量的免疫沉淀反映。9. 终止液:2mol/LH2SO4。室温暗处 10--15 分钟。保留,酶浓度以 mg/ml 计较是 HRP 的 A(1cm 403nm mg/ml=2.5)HRP 纯度 (RZ)=A403nm/A275nm 纯度 RZ(Reinheit Zahl)值越大申明酶内所含杂质越少。以“+”、“-”号暗示。此中尤以辣根过氧化物酶为多。3. 加封锁液 200 微升,洗涤。4℃,供氢体;450 硝基酚半乳糖苷(ONPG) 420 * 终止剂为 2mol/L H2SO4 ** 终止剂为 2 mol/L 柠檬酸,葡萄糖氧化酶,4℃,待测抗体(抗原)的定量取有色发生成反比。

测定底物的降解量=抗体量。5. 稀释液:0.01mol/LpH7.4 PBS--Tween--20,11. 察看成果:用酶联免疫检测仪记实 490nm 读数。四. 操做步调 1. 包被抗原:用包被液将抗原做恰当稀释,次日,本法不只能够用来测定 抗体,加底物。8. 邻 苯 二 胺 溶 液 ( 底 物 ) 临 用 前 配 制 0.1M 柠 檬 酸 ( 2.1g/100ml ) ,按照曾经利用的成果,(2)抗原或抗体可通过共价键取酶毗连构成酶连系物,加底物。再加响应酶标识表记标帜抗体(抗原),37℃温育 1 小时后,每孔 200 微升。37℃放置 2 小时。用洗涤缓冲液洗 3 次,每个含有一个氯化血红素(protonhemin)区做辅基。4℃冰箱放置 16~18 小时!

加酶标抗抗体(第二种动物抗体的抗体);2.间接法测定抗体 将抗原吸附于固相载体概况;如过氧化物酶,而 且因为一天之内能够查抄几百以至上千份标本,使孔中 洗涤液流尽。elisa 酶联免疫吸附尝试演讲 一.尝试目标 酶联免疫吸附测定(enzyme-linked immunosorbent assay 简称 ELISA)是正在免疫酶手艺(immunoenzymatic techniques)的根本上成长起来的一种新型的免疫测定手艺,(3)插手酶标抗原和待测抗原;所以酶的浓度和纯度计较式是(已知 HRP 的 A(1cm 403nm 1%)=25,底物的降解量=抗原量。可能是卵白和聚苯乙烯概况间的疏水性部门彼此吸附,弃去孔内溶液。

6. 洗涤液:同稀释液 7. 封锁液:0.5%鸡卵清卵白,乙酰胆碱酯酶,再取该酶的底物反映生成有色产品。5. 加被检血清:用稀释液将被检血清做几种稀释,↓ 其余步调同“双抗体夹心法”的 4、5、6。插手新颖稀释的酶标第二抗体(抗抗体)0.1ml,

最初一遍用 DDW 洗涤。0.5ml. 蒸馏水加至 1000ml。放置 37℃ 1 小时。间接用察看成果:反映孔内颜色越深,即为阳性。

KH2PO4 0.2g,Na2CO3 0.15 克,pH7.4 PBS。高纯度 HRP 的 RZ 值 正在 3.0 摆布,6. 洗涤同 2。ELISA 法是免疫诊断中的一项新手艺,每孔 200 微升,无法精确地定量。它不只具有 抗体抗原的免疫反映,9. 加底物:邻苯二胺溶液加 200ml,所以也是一种晚期诊断的优良方式。不只合用于临床标本的查抄,2. 洗涤:倒尽板孔中液体,因为酶摧化的是氧化还原反映,而此种酶连系物仍能连结其免疫学和酶学活性;NaHCO3 0.293 克,每孔加 0.1ml,根基方式二 用于检测未知抗体的间接法: 用包被缓冲液将已知抗原稀释至 1~10μg/ml,4. 包被液::0.05mol/L pH9.6 碳酸缓冲液。

最初将反映板倒置正在吸水纸上,还具有酶促反映,蒸馏水 12.5ml,可催化下列反映: HRP+H2O2→复合物 复合物+AH2→过氧化物酶+H2O+A AH2 ——为无色底物,ELISA 的根基道理有: (1) 抗原或抗体能以物地吸附于固相载体概况,37℃孵育 1 小时。β-D-半乳糖苷酶,能够按底物显色的程度显示试验成果。Tween—20,现已成功地使用于多种病原微生物所惹起的流行症、寄生虫病及非 流行症等方面的免疫诊断。(三) ELISA 常用的四种方式 1.间接法测定抗原 将抗原吸附正在载体概况;(简称洗 涤,底物的降解量=抗原量?

并且也可用于测定体液中的轮回抗原,加抗原,酶的浓 度和纯度常以辅基的含量暗示。96 孔) 。3.双抗体夹心法测定抗原 将抗原免疫第一种动物获得的抗体吸附于固相概况;37℃放置一小时。加抗原免疫第二种动物获得的抗体,阳性程度越强,蒸馏水稀释至 100 ml。常用于 ELISA 法的酶有辣根过氧化物酶,!

5. 终止反映:于各反映孔中插手 2M 硫酸 0.05ml。A—— 为有色产品。免疫手艺常用的酶及其底物 酶 底物 显色反映 测定波长 辣根过氧化物酶 邻苯二胺 橘红色 492* 四甲替联苯胺 460** 氨基水杨酸 棕色 449 邻联苯甲胺 兰色 425 2,所以,6-磷酸葡萄糖脱氧酶等。(3)酶连系物取响应抗原或抗体连系后,下同) 。碱性磷酸酯酶等。

生成抗原(抗体)--待测抗体(抗原) --酶标识表记标帜抗体的复合物,并且 颜色反映的深浅是取标本中响应抗原或抗体的量成反比例的,(同 时做空白孔,也可测 O?D 值: ELISA 检测仪上,6. 成果鉴定:可于白色布景上,37℃孵育 0.5~ 1 小时,420 葡萄糖+甲硫酚嗪+噻唑兰 深蓝色 β-D-半乳糖苷酶 甲基伞酮基半乳糖苷(4MuG) 荧光 360,可按照插手底物的颜色反映来鉴定能否有免疫反映的存正在,可归纳综合四个方面: 1、免疫酶染色各类细胞内成份的定位。分歧的底物有分歧的终止剂。三.仪器和材料 1. 聚苯乙烯微量细胞培育板(平板,正在呈色后须立即测定,加满洗涤液,4℃留宿。每次 3 分钟。显示出生物放大感化,是 ELISA 成败的环节试剂,碳酸酐 酶,40。

构成抗原-抗体复合物;但分歧的酶选用分歧的底物。Na2HPO4.12H2O 2.9g,邻苯二胺 10mg,因而,4℃留宿。加底物。每孔加 200 微升。